Una de las principales fuentes de nitrógeno biológicamente fijado en el sistema agrícola es a través de la simbiosis que ocurre entre rizobia (término que abarca a los géneros bacterianos: Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium y Allorhizobium) y las leguminosas. Rizobia es capaz de colonizar en forma específica las raíces de las leguminosas e inducir en ellas órganos especializados, llamados nódulos, donde ocurre la fijación del N2. La formación del nódulo requiere una secuencia de eventos altamente regulados y coordinados que comienza con el intercambio de señales entre la planta hospedadora y la bacteria simbionte. Nuestro objetivo general es estudiar a nivel molecular la interacción de Mesorhizobium loti con las leguminosas analizando tanto el papel que tienen distintos componentes bacterianos así como la respuesta que se genera en la planta.
Dra. Viviana Claudia LepekMiembros actualesPh.D., Profesora Adjunta UNSAM
Profesora a cargo de la materia Métodos de Análisis Biomédicos
Dictado de clases en Microbiología General
Evaluadora del curso de Seminarios
Lic. Andrés Zalguizuri: Lic. en Biotecnología, Tesista UNSAM
Ana Clara González: estudiante tesinista UADE
Dra Laura Ana Basile: Investigadora Asistente del Conicet.
Componentes bacterianos relevantes para la eficiencia del proceso simbiótico y/o para la competitividad para la nodulación.
En el laboratorio hemos estudiado el rol en la interacción Mesorhizobium loti Ayac 1 BII (cepa autóctona)-Lotus spp, de genes involucrados en la síntesis de distintos componentes bacterianos: gen de la fosfoglucomutasa (pgm) y gen de la glucógeno sintasa (glgA) (1), gen de la glucano cíclico sintasa (cgs), y genes involucrados en la síntesis del lipopolisacárido (lpsβ1 y lpsβ2) (2, 4). Actualmente nos encontramos caracterizando los sistemas de secreción de proteínas en Mesorhizobium loti MAFF303099 y el papel que cumplen en la interacción tanto con Lotus spp., como con Leucaena leucocephala. Hemos comenzado con la caracterización del sistema de secreción de tipo III (T3SS). Mediante una búsqueda in silico de posibles efectores secretados por este sistema identificamos 3 posibles candidatos (6) y determinamos su participación en el proceso de nodulación (8). Actualmente estamos finalizando la caracterización del sistema de secreción TAT de M. loti MAFF303099 y de dos proteínas Rieske Fe/S secretadas por el mismo cuya funcionalidad está involucrada en el proceso simbiótico (manuscrito en preparación). También hemos adjudicado una función para una proteína codificada en el cluster de genes del T3SS cuya función no se conocía. La proteína Y4yS codificada por el gen mlr8765 participaría en la localización de la secretina del T3SS en membrana (10). Recientemente hemos determinado la existencia de una regulación inversa entre la expresión del factor transcripcional TtsI, que regula positivamente el sistema de secreción de tipo III, y la producción del flagelo (11).
Cambios a nivel transcripcional generados en raíces de Lotus japonicus durante el proceso de nodulación.
En el laboratorio hemos analizado el transcriptoma inducido en raíces de Lotus japonicus durante el proceso de nodulación que ocurre ante la inoculación con M. loti Ayac 1 BII cepa silvestre y comparado el mismo con aquel que se observa al inocular en cambio con una mutante afectada en la síntesis del glucano cíclico (mutante cgs) o con otra afectada en la síntesis del antígeno O del lipopolisacárido (mutante lpsβ2) (5). Se encontraron cientos de genes diferencialmente inducidos al comparar la inoculación con la cepa silvestre respecto a la inoculación con la mutante cgs. La inducción de estos genes dependería de la capacidad de la bacteria de invadir el nódulo (5). Muchos de estos genes a su vez mostraron un retardo en su inducción al inocular con la mutante lpsβ2 en concordancia con la mayor dificultad de esta cepa comparada con la silvestre en ocupar el nódulo (5). Entre los genes diferencialmente inducidos se encuentran varios relacionados con respuesta de defensa. Mediante el ensayo de RT-PCR en tiempo real se analizó la cinética de la expresión de algunos de estos genes. Los resultados obtenidos evidencian la existencia de un control de la respuesta de defensa de la planta por parte de la bacteria (5).
Predicción de proteínas secretadas por distintos sistemas de secreción bacterianos.
Se diseño una metodología novedosa para la predicción de efectores secretados por los sistemas de secreción de tipo III, IV y VI de bacterias basado en la dependencia evolutiva que mantienen los distintos efectores con el sistema por el cual se secretan. Este método no depende de la presencia de secuencias señal específicas (manuscrito en preparación).
Efecto de la expresión constitutiva de la enzima ACC deaminasa en el proceso de nodulación y micorrización.
La simbiosis entre leguminosas y rizobia favorece el crecimiento de la planta en ausencia de fertilizantes nitrogenados. La fitohormona etileno, que se induce ante distintas condiciones de estrés, afecta negativamente esta asociación. En el laboratorio construímos cepas de M. loti que expresan en forma constitutiva la enzima ACC deaminasa, capaz de reducir la formación de etileno en su entorno, y evaluamos su efecto sobre la eficiencia de nodulación, la competitividad bacteriana para la nodulación así como sobre la nodulación en distintas condiciones de estrés (7).
Obtención de cepas de Bradyrhizobium japonicum resistentes a glifosato.
El glifosato es el herbicida comúnmente usado en los cultivos de soja transgénica. Bradyrhizobium japonicum (la bacteria que nodula la soja), al igual que las plantas, posee los genes que codifican para las enzimas utilizadas en el metabolismo del ácido shikímico, sustrato para la producción de compuestos aromáticos (flavonoides, aminoácidos aromáticos, etc). La actividad de una de estas enzimas, la 5-enolpiruvilshikimato-3 fosfato sintasa (EPSPS) es inhibida por el glifosato, por lo tanto la presencia de glifosato en el campo afecta el crecimiento de la bacteria y por ende el proceso de nodulación y el rendimiento de los cultivos de soja. Hemos obtenido, mediante mutagénesis puntual del sitio activo de la enzima, una cepa de B. japonicum tolerante al glifosato. Este trabajo fue seleccionado para ser expuesto en INNOVAR 2014 (9).